Un agonista Nurr1 ottimizzato fornisce la malattia | Chengdu CFilling Machine Group Co.,Ltd

Nature Communications volume 14, numero articolo: 4283 (2023) Citare questo articolo

3438 accessi

46 Altmetrico

Dettagli sulle metriche

Il recettore nucleare, Nurr1, è fondamentale sia per lo sviluppo che per il mantenimento dei neuroni della dopamina nel mesencefalo, rappresentando un promettente bersaglio molecolare per la malattia di Parkinson (MdP). Abbiamo precedentemente identificato tre agonisti Nurr1 (amodiachina, clorochina e glafenina) che condividono un'identica impalcatura chimica, 4-ammino-7-clorochinolina (4A7C), suggerendo una relazione struttura-attività. Qui riportiamo una ricerca sistematica di chimica medicinale in cui sono stati generati e caratterizzati oltre 570 derivati 4A7C. Diversi composti migliorano l'attività trascrizionale di Nurr1, portando all'identificazione di un agonista ottimizzato, penetrante nel cervello, 4A7C-301, che mostra robusti effetti neuroprotettivi in vitro. Inoltre, 4A7C-301 protegge i neuroni della dopamina del mesencefalo nel modello murino maschio di PD indotto da MPTP e migliora i deficit olfattivi sia motori che non motori senza comportamenti simili alla discinesia. Inoltre, 4A7C-301 migliora significativamente le anomalie neuropatologiche e migliora le disfunzioni motorie e olfattive nei modelli murini maschili con sovraespressione di α-sinucleina mediata da AAV2. Queste proprietà di modificazione della malattia del 4A7C-301 possono giustificare la valutazione clinica di questo o di composti analoghi per il trattamento di pazienti affetti da PD.

La malattia di Parkinson (MdP), che colpisce il 2-3% della popolazione di età superiore ai 65 anni, è la seconda malattia neurodegenerativa più comune, dopo la malattia di Alzheimer1,2,3. La degenerazione selettiva dei neuroni della dopamina del mesencefalo (mDAN) nella substantia nigra e l'accumulo e l'aggregazione di α-sinucleina neurotossica (αSyn) nei corpi di Lewy sono caratteristiche patologiche distintive del PD. Si ritiene che la manifestazione della malattia di Parkinson sia causata dall'azione combinata di fattori genetici e ambientali attraverso molteplici percorsi interagenti tra cui disfunzione mitocondriale, stress ossidativo, neuroinfiammazione e degradazione/autofagia proteica disregolata3,4,5,6,7. Attualmente, la terapia sostitutiva con dopamina (DA) (ad esempio, L-DOPA) è il trattamento gold standard. Sebbene migliori significativamente la qualità della vita dei pazienti con malattia di Parkinson, la finestra terapeutica senza effetti collaterali inaccettabili, come la discinesia, e il grado di beneficio diminuiscono entrambi nel tempo8,9, e non esiste alcun trattamento che possa arrestare o rallentare la progressione della malattia. Pertanto, esiste un grande bisogno insoddisfatto di sviluppare nuovi trattamenti modificanti la malattia per la PD10,11.

Nel corso degli ultimi decenni, le cascate di regolazione trascrizionale degli mDAN sono state studiate in modo esauriente12. Due principali percorsi di sviluppo mDAN (vale a dire, Sonic hedgehog-FoxA2 e Wnt1-Lmx1A) convergono per indurre Nurr113,14,15, evidenziando Nurr1 come regolatore principale per mDAN. Infatti, studi su topi knockout (KO) e KO condizionali per Nurr1 hanno dimostrato che Nurr1 è essenziale non solo per lo sviluppo16 ma anche per il mantenimento degli mDAN adulti17. Inoltre, è stato dimostrato che Nurr1 protegge gli mDAN dalla morte indotta dalla neuroinfiammazione sopprimendo l'espressione di geni proinfiammatori neurotossici4. Inoltre, è stato riportato che l'espressione di Nurr1 è significativamente ridotta nel cervello dei pazienti con PD sia anziani che sporadici18,19,20.

Nurr1 appartiene alla sottofamiglia dei recettori nucleari NR4A, suggerendo che la sua funzione di trascrizione può essere modulata da ligandi sintetici e/o endogeni21. Inoltre, Nurr1 può funzionare come attivatore trascrizionale e come repressore, a seconda del contesto cellulare (ad esempio, rispettivamente in mDANs16 e microglia4). Per iniziare a valutare se Nurr1 potrebbe essere un bersaglio molecolare per il trattamento modificante la malattia del PD22, abbiamo creato sistemi di analisi ad alta produttività e precedentemente esaminato una libreria di farmaci approvati dalla FDA statunitense. Abbiamo identificato tre farmaci, ovvero amodiachina (AQ), clorochina (CQ) e glafenina, che migliorano significativamente l'attività trascrizionale di Nurr1 attraverso il legame diretto al suo dominio di legame del ligando (LBD)23. Tutti e tre i farmaci condividevano un'impalcatura chimica identica, vale a dire. 4-ammino-7-clorochinolina (4A7C), spingendoci a ipotizzare che questo motivo 4A7C rappresenti una relazione struttura-attività (SAR) che potrebbe essere utilizzata per identificare migliori derivati 4A7C con maggiore potenza e minori effetti collaterali attraverso medicinali basati sulla SAR chimica24. In linea con questa ipotesi, lavori recenti di Munoz-Tello et al. 25 e Willems et al. 26,27 hanno mostrato che AQ e CQ e i loro derivati possono funzionare come agonisti Nurr1. Willems et al. 26 hanno anche riportato che la rimozione del gruppo 7-cloro o 4-ammino del farmacoforo 4A7C porta alla perdita di attività, supportando ulteriormente la nostra ipotesi che 4A7C sia un farmacoforo valido per la progettazione di potenti agonisti Nurr1. A tal fine, abbiamo effettuato uno sforzo sistematico di chimica medicinale utilizzando il CQ come composto di partenza perché è relativamente sicuro ed è ancora ampiamente utilizzato per trattare malattie umane come la malaria e le malattie autoimmuni28. Abbiamo caratterizzato molteplici (>570) derivati 4A7C utilizzando test biochimici, molecolari e cellulari e abbiamo identificato un candidato finale, 4A7C-301, che mostra una potenza decisamente più elevata e fornisce effetti neuroprotettivi basati su meccanismi sia in modelli in vitro che in vivo di PD , utilizzando separatamente sia un modello di fattore di rischio ambientale (l'inibitore del complesso I mitocondriale 1-metil-4-fenilpiridinio (MPP+)) che genetico (αSyn) del PD. A differenza di L-DOPA o CQ, 4A7C-301 ha migliorato significativamente le disfunzioni motorie e non motorie senza effetti collaterali come comportamenti simili alla discinesia o inibizione dell'autofagia. I nostri dati dimostrano la prova di principio che gli agonisti Nurr1 ottimizzati possono fornire un trattamento modificante la malattia sia per la malattia di Parkinson sporadica che familiare.

morpholine > piperidine, the derivative 4A7C-301 with highest fold-induction (18.12 fold) and significantly lower EC50 value (6.53 µM) than CQ (50.25 µM) was selected as a preclinical candidate for further studies (Fig. 1c; Supplementary Table 1). Brain permeability of 4A7C-301 was assessed by analysis of blood plasma and brain homogenates at different time points after oral administration in SD rats (20 mg/kg). 4A7C-301 penetrated into the brain well and was consistently maintained in the brain (Supplementary Fig. 1a–c)./p>60%) together with activation of ionized calcium-binding adaptor molecule 1 (Iba-1)-positive microglia. Pre-treatment with CQ or 4A7C-301 significantly rescued mDANs in a dose-dependent manner. 4A7C-301 showed maximal effect at 500 nM, which is a 40 times lower concentration than required for a similar CQ effect (20 µM) (Fig. 2d, e). In addition, 4A7C-301 optimally suppressed microglial activation against LPS at 500 nM, which is 40 times lower than CQ (Fig. 2f, g). To address whether CQ and 4A7C-301 can suppress the expression of pro-inflammatory genes in microglia (in the absence of mDANs), we used LPS to induce inflammation in mouse microglia-derived BV2 cells, leading to a dramatic induction of the tumor-necrosis factor-α (TNFα) gene, which was robustly suppressed by CQ and 4A7C-301 (Supplementary Fig. 6). In this assay, 4A7C-301 exhibited a much higher potency than CQ, with EC50 of ~1 and ~100 nM, respectively. Collectively, our data show that 4A7C-301 protects mDANs from MPP+- and LPS-induced cell death while suppressing neuroinflammation with a much higher potency than CQ for both effects./p> 0.05), one-way ANOVA. Data are mean ± s.e.m. n = 8 per group. g, h Immunohistochemical analyses of TH+ neurons by densitometry in the STR. Scale bar, 500 µm. One-way ANOVA, Tukey’s post-hoc test; n = 5 per group. Data are mean ± s.e.m. i–k Immunohistochemical analyses of TH+ DA neurons (I, j) and NeuN+ neuros (I, k) in the SNpc. Scale bars, 500 µm.One-way ANOVA, Tukey’s post-hoc test; j, n = 5 per group; k, n = 4 per group. Data are mean ± s.e.m. l Representative pS129 immunohistochemistry in the SNpc. Scale bars, 250 µm. m, Quantification of pS129 αSyn+ cells by counting. One-way ANOVA, Tukey’s post-hoc test; n = 5 per group. Data are mean ± s.e.m. n Western blot analyses of human-αSyn in the SNpc of AAV-αSyn-injected mice. Values are expressed as a relative expression compared to contralateral side. One-way ANOVA, Tukey’s post-hoc test; n = 3 per group. Data are mean ± s.e.m. o–q Immunohistochemical analyses of Iba-1+ microglia by counting in the STR (p) and SNpc (q). One-way ANOVA, Tukey’s post-hoc test; n = 5 per group. Data are mean ± s.e.m. Scale bars, 250 µm./p>570 derivatives of CQ and characterized them, resulting in the identification of an optimized agonist, 4A7C-301. Here, we tested 4A7C-301 and CQ for their effects on various in vitro and in vivo models of PD and propose that 4A7C-301 may provide a disease-modifying treatment for PD, as evidenced by the following results./p>20-fold), suggesting a mechanism-based Nurr1 activation. Our data revealed that 4A7C-301 effectively enhances both Nurr1’s transcriptional activator function (e.g., expression of mDAN-specific genes and production of DA in mDANs) and its repressor function (e.g., suppression of pro-inflammatory cytokine genes and microglial activation) with equally greater efficiency than CQ (>20-fold). Second, we observed that treatment with CQ or 4A7C-301 significantly restored Nurr1 protein levels that were reduced by MPP+ treatment and αSyn overexpression without change in their mRNA levels, strongly suggesting that Nurr1 ligands can regulate the levels of Nurr1 protein at the post-transcriptional levels. Thus, we speculate that Nurr1 ligands may regulate Nurr1 protein’s stability, which is vulnerable and down-regulated by environmental (MPP+) and/or genetic (αSyn) toxicity and that 4A7C-301 (and CQ to a lesser degree) exhibits neuroprotective effects by two distinct mechanisms: (1) activating Nurr1’s transcriptional function and (2) stabilizing and restoring Nurr1 protein levels. Third, using diverse cellular models, we found that 4A7C-301 substantially protects mDA cells via multiple downstream pathways such as reduction of oxidative stress and cytotoxicity, protection of mitochondrial function, induction of mDAN-specific gene expression, including GDNF-receptor c-ret, and reduction of neuroinflammation. Furthermore, while CQ inhibits autophagy, 4A7C-301 does not. In fact, 4A7C-301 restores cellular autophagy functions impaired by MPP+ treatment. Since CQ is a prototype autophagy inhibitor and known to accelerate the deposition of αSyn pathology55, CQ’s autophagy inhibition and 4A7C-301’s autophagy protection is an important distinction. We speculate that the same core structure allows CQ and 4A7C-301 to bind Nurr1 (related to the putative SAR) and show similar activities in most assays, while their different side chain structures most likely underlie their distinct effects on autophagy. In support of this, CQ and BafA1, both well-known autophagy inhibitors, significantly increased lysosomal pH, while 4A7C-301 had no effect, suggesting possible mechanisms underlying CQ/4A7C-301’s different effects on autophagy. Fourth, in MPTP- and αSyn-induced mouse models, 4A7C-301 significantly restored motor deficits and non-motor behavior (e.g., olfactory defects) without any dyskinesia-like side effects. A major limitation of current pharmacological treatments of PD is that they eventually induce side effects such as dyskinesia in many patients8,9. As expected, L-DOPA administration induced robust dyskinesia-like behavior in MPTP-induced mice. In sharp contrast, despite comparable improvements in motor tests, treatment with 4A7C-301 or CQ did not induce any detectable dyskinesia-like behavior. A possible action mechanism of 4A7C-301/CQ in the MPTP model is that they may influence metabolism of MPTP to MPP+. However, this explanation is unlikely because 4A7C-301/CQ were administered 6 h post MPTP injection, the time point when MPTP is completely metabolized into MPP+ in both the striatum and SN56./p>

50% of the observation time; 3 = display dyskinesia for the entire observation period but ceased upon external stimuli; 4 = display continuous and unceasing dyskinesia). To get a better and more sensitive validation of mice dyskinesia, we included an amplitude AIMs score, which rates the degree of deviation of body part or muscle position from its resting position on a 0-4 scale as previously described8. Finally, global AIMs score was calculated by multiplying basic AIMs and amplitude AIMs scores for each subtype on each session. Data points were plotted as the grand total of individual AIMs score on each testing day./p>